DUB 抑制剂筛选完整实验流程与关键控制点

实验流程总览

1. 化合物与试剂准备
2. 酶反应体系建立
3. 荧光信号采集
4. 数据处理与 QC 评估
5. Hit 判定与确认

1. 化合物与试剂准备

待测化合物用 DMSO 配制成 10 mM 储备液，-20°C 保存。实验当天用反应缓冲液稀释至工作浓度。DMSO 终浓度应控制在 1% 以下，超过此浓度需设 DMSO 对照组评估溶剂效应。

阳性对照推荐使用广谱 DUB 抑制剂 PR-619 或 N-ethylmaleimide (NEM)，阴性对照为等体积 DMSO。

2. 酶反应体系

典型 100 μL 反应体系：50 mM HEPES (pH 7.5)、0.5 mM TCEP、0.1 mg/mL BSA、0.01% Brij-35、重组 DUB 酶（浓度根据预实验确定，使荧光信号在前 30 min 内呈线性）、化合物或 DMSO、底物（Ub-AMC 1 μM 或 Ub-Rho110 0.2 μM）。

加样顺序：缓冲液 → 化合物 → 酶 → 预孵育 10 min → 加入底物启动反应。此顺序确保化合物与酶充分作用后再加入底物竞争。

3. 数据采集

荧光读板机设置：Ub-AMC (Ex 345/Em 440)，Ub-Rho110 (Ex 498/Em 520)。连续读数模式，每 1–2 min 读取一次，持续 30–60 min。反应温度控制在 25°C 或 37°C。

4. 关键 QC 参数

• Z' 因子 ≥ 0.5（推荐 ≥ 0.7）。低于 0.5 表示检测窗口不足以区分阳性和阴性对照
• S/B (信背比) ≥ 5。低于 3 需优化酶浓度或底物浓度
• CV% 阴性/阳性对照孔间变异系数 ≤ 10%
• 阳性对照抑制率 ≥ 85%（用 PR-619 50 μM 验证）

5. Hit 判定

初筛 Hit 标准：抑制率 ≥ 50%（单浓度 10 μM）。确认 Hit：IC50 ≤ 10 μM（8 点浓度梯度，复孔）。对于竞争性抑制剂，建议正交验证使用 Ub-PA 探针进行靶点占位实验。